91精品国产91久久久久福利精东_国产亚洲日韩欧美另类丝瓜app_偷国内自拍视频在线观看_亚洲一区二区三区自拍天堂_日韩亚洲精品不卡在线_日本丰满少妇裸体自慰_**片免费全部播放一级_沈阳45老熟女激烈的高潮_亚洲高清无码第一_日韩精品欧美综合

您現(xiàn)在的位置:首頁 > 技術文章 > D-脫硫生物素應用之一

D-脫硫生物素應用之一

  • 發(fā)布日期:2017-11-30      瀏覽次數(shù):4543
    • 規(guī)模化分選純凈種子細胞的新方法

       

      中國是世界人口大國,因創(chuàng)傷、疾病、遺傳、衰老等因素造成的組織和器官缺損、衰竭或功能障礙的患者人數(shù)位居世界各國,以藥物和手術治療為基本支柱的經典醫(yī)學治療手段,已不能滿足臨床醫(yī)學的巨大需求。細胞治療可以通過移植對應組織的細胞來修復發(fā)生了病變、衰老或損傷的組織器官,從而更新其生理功能,為組織器官缺損所致的疾病提供全新的治療手段。但是,這種方法需要有足夠數(shù)量對應類型的細胞,通過常規(guī)的捐獻方法很難達到臨床上對數(shù)量和類型的要求,因而面臨著細胞來源短缺的嚴重問題,這在很大程度上阻礙了細胞治療的發(fā)展步伐。干細胞在體外培養(yǎng)條件下能夠維持自我更新,還能夠被誘導成為機體幾乎所有細胞類型,因而可以為臨床疾病的細胞治療提供重要的種子資源細胞。特別是間充質干細胞的出現(xiàn),其具有高度的自我更新能力和多向分化潛能,因取材方便、體內植入后不良反應較弱等優(yōu)點而備受關注,成為細胞替代治療的理想種子細胞,在細胞治療中有更廣闊的應用前景。

      統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),間充質干細胞可用于治療自身免疫病、神經系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、骨骼及運動系統(tǒng)等多種疾病,且近年來間充質干細胞用于疾病治療的案例逐年增加,并有顯著效果,因而推動間充質干細胞臨床應用是對人類健康做出重大貢獻的舉措。除此之外,胚胎干細胞(ES)和誘導多功能干細胞(iPS)通過誘導都能夠分化成為不同類型的細胞,都是細胞治療潛在的種子細胞。但是,在誘導分化過程中由于細胞分化程度不一,因而獲得特定分化階段的細胞對臨床轉化中的療效和安全性都有重要意義。在這種情況下,如何較快獲得高質量、足數(shù)量的目的細胞成為細胞治療亟待解決的問題。 

      么,如何解決這個問題,以推動間充質干細胞的臨床應用呢?長期探索該問題的中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院的研究團隊將這個問題分解為3個部分:細胞來源、細胞質量以及細胞獲取方式。

      在細胞來源方面,間充質干細胞可從多種組織中獲取,但迄今為止,臍帶仍是的細胞來源。臍帶是胎兒與母體之間的紐帶,這股紐帶在分娩后通常被當做生物垃圾處理。但臍帶中蘊含著豐富的間充質干細胞,且使用臍帶間充質干細胞不會對母體和胎兒產生任何傷害。在細胞質量方面,臍帶間充質干細胞在臨床應用中體現(xiàn)出其他來源干細胞所不具備的*性,包括免疫原性低、副作用小等,是細胞治療的高質量選擇。在細胞獲取方式方面,目前臍帶間充質干細胞主要通過組織塊貼壁法獲得,但是這種方法需要花費較長的時間,而且操作過程復雜,從得到臍帶到zui終收獲細胞通常需要14~22天,妨礙了細胞治療的臨床應用。

      為了促進間充質干細胞在組織工程和細胞治療中的應用,科研工作者提出了許多新的細胞分選策略,以提高細胞的分選效率:除了目前較為流行的流式細胞術和免疫磁珠法外,還有基于細胞大小和密度的分選方法、基于沉降作用的分選方法以及發(fā)展的基于核酸識別細胞表面抗原的分選方法等,但這些方法或是分選純度不高,或是操作復雜、成本較高、對儀器依賴性強等,均不適用于大規(guī)模分選細胞。另外,流式細胞術中應用了熒光素標記抗體,分選后熒光素的存在會影響細胞的后續(xù)培養(yǎng),而免疫磁珠法分選的細胞磁珠仍殘留在細胞上,也會造成一定的細胞毒性,雖然有些磁珠分選方法可通過酶消化zui終除去磁珠,但酶消化的同時也會破壞細胞表面抗原分子的結構。面對細胞分選技術面臨的種種問題,研究團隊希望研制出簡單、快速、有效、無損、可逆,能夠規(guī)模化獲取間充質干細胞并且不影響細胞的生存率和生物功能的細胞分選方法,目前已初步找到了兩種潛力的方案。 

      研究團隊的*種方案利用了海藻酸和生物素-親合素系統(tǒng)(Biotin-Avidin System,BAS)。海藻酸是一種天然多聚糖,是構成海藻的細胞壁和細胞間質的主要成分;它屬于陰離子型共聚物,可以與金屬離子結合形成各種海藻酸鹽,具有良好的生物相容性與低毒性,而且具有很強的成膠能力,工業(yè)上將海藻酸及其衍生物產品統(tǒng)稱為海藻膠或褐藻膠。除海藻酸外,商業(yè)上有實用價值的海藻酸衍生物為水溶性的海藻酸鹽,包括海藻酸鈉、海藻酸鉀、海藻酸鈣、海藻酸銨、海藻酸丙二醇酯等,其中海藻酸鈉是制備多種海藻酸衍生物的*前體。

      海藻酸鈉屬于陰離子多糖,其溶液可以與多種物質混溶,同時也很容易與除鎂離子以外的高價陽離子、陽離子表面活性劑及強酸鍵合形成凝膠沉淀,且形成的凝膠結構具有熱不可逆性。但通過改變pH值和加入螯合物等條件可以使凝膠解聚,瓦解凝膠結構,改變這種不可逆性。當離子螯合劑乙二胺四乙酸(EDTA)存在時,鈣離子與EDTA結合,海藻酸鈣凝膠失去鈣離子而解聚,重新形成水溶性的海藻酸。根據(jù)這一可逆過程,研究團隊制備了海藻酸修飾的磁性納米顆粒,形成了細胞無損可逆分選的基礎之一。

      生物素-親合素系統(tǒng)是20世紀70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應放大系統(tǒng)。生物素環(huán)形結構中的環(huán)為咪唑酮環(huán)(又稱Ureido環(huán)),是與親合素結合的主要部位;生物素的環(huán)結構為噻吩環(huán),帶有一個戊酸側鏈,末端羧基是標記抗體和酶的*結構。由于生物素分子很小,因而抗體分子和酶經生物素化后,仍能保持其原有活力不變;細胞經生物素化后仍能保持正常的分裂、增殖能力,因此生物素常作為抗體、酶和細胞的標記。生物素-親合素系統(tǒng)的高度特異性、高度靈敏性是實現(xiàn)細胞無損可逆分選的另一基礎。

      在基于海藻酸的自組裝和生物素-親和素系統(tǒng)的細胞分選方法中,研究團隊首先將海藻酸用鏈酶親和素標記,并將其修飾在海藻酸包裹的磁性納米顆粒上,然后對靶標分子的抗體進行生物素標記;當抗體與細胞孵育并結合到相應細胞表面標志物上后,再與鏈酶親和素修飾的磁性納米顆粒孵育,通過生物素-親和素系統(tǒng)的特性將細胞與磁性納米顆粒鏈接;zui后在磁性富集得到的目的細胞中加入EDTA,使海藻酸鈣瓦解、磁珠從細胞上釋放,即可得到不含磁珠的目的細胞(見圖1)。該步驟可使用不同抗體重復進行,直至得到目的細胞。

      通過這種方法,研究團隊成功從臍帶中分離得到了臍帶間充質干細胞,分選效率高達90%(見圖2),得到的細胞數(shù)目為每厘米150~200萬個,遠高于傳統(tǒng)組織塊貼壁法所得到的細胞數(shù)目(每厘米2.5萬~25萬個),且得到的細胞經過誘導能夠分化為骨細胞和脂肪細胞

      究團隊的另一種方案利用了生物素/D-脫硫生物素與鏈霉親和素的結合能力差異,被稱為“基于生物素/D-脫硫生物素素競爭結合鏈霉親和素的細胞分選方法”。D-脫硫生物素是生物機體合成生物素的原料,是不含硫的生物素類似物,其與親和素的結合能力是生物素的十萬分之一,因而當D-脫硫生物素與親和素結合時能夠在溫和的條件下被生物素競爭取代,從而保證被分選細胞和大分子的完整性。

      與生物素一樣,親和素上同樣也有4D-脫硫生物素的結合位點,因而可利用生物素-親和素系統(tǒng)級聯(lián)放大信號的作用,將傳統(tǒng)的免疫磁珠細胞分選方法進行改良,使細胞表面的抗原放大,更易于被捕獲;此外,有些細胞表面標記物表達量較低,也可通過這種級聯(lián)放大提高捕獲效率。

      該方法的實施過程為:將靶標分子的抗體用D-脫硫生物素進行標記后與細胞孵育,通過抗原-抗體結合捕獲目的細胞,將其與親和素標記的磁珠進行孵育,使細胞富集到磁珠上,磁性富集即可分離目的細胞,zui后通過與生物素孵育使細胞從磁珠上釋放,得到不含磁珠的目的細胞(見圖4)。該方法無須使用熒光素標記抗體和抗體標記磁珠,避免了熒光素和磁珠可能對細胞產生的細胞毒性,為細胞的后續(xù)增殖和使用提供了質量保障。除此之外,該方法獲得的細胞不僅不含磁珠,而且細胞上的殘留物更少,在保證目的細胞表面蛋白不受破壞的前提下,為獲得純凈的細胞提供了新的思路。

      基于臍帶間充質干細胞在臨床應用中顯示出的其他干細胞*的*性,研究團隊對該方法的實際可行性進行了驗證,結果表明,與傳統(tǒng)的免疫磁珠分選法相比,采用該方法分選得到的細胞增殖效率沒有明顯差別(見圖5)。

      研究團隊綜合利用海藻酸的自組裝、生物素、D-脫硫生物素競爭結合鏈霉親和素、生物素-鏈霉親和素系統(tǒng),旨在建立細胞無損可逆分選的新策略,為快速、簡便地獲得數(shù)量足夠、質量均一的臨床級細胞提供理論依據(jù)和技術基礎,推動干細胞應用的臨床轉化。綜合看來,研究團隊建立并驗證的兩種方法能夠簡便、快速地獲得目的細胞,可以滿足臨床上短期內對特定類型細胞的大量需求,具有重要的實用價值;同時還能為基礎研究中獲得特定階段、特定類型的細胞提供技術支撐,節(jié)約時間和成本。因而,這兩種方法對干細胞的基礎研究和應用轉化均有重要的參考價值。

       

       

      基于在無損、可逆分選細胞方法方面的進展和突破,研究團隊將繼續(xù)進行探索和研究,圍繞簡單、快速地獲得不含任何外源物(包括抗體)的目的細胞這一*目標,在后續(xù)工作中開發(fā)出更好的技術與設備,為推動干細胞的理論研究和轉化應用提供先進的