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談?wù)動(dòng)嘘P(guān)NEB內(nèi)切酶反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)和技巧

  • 發(fā)布日期:2018-03-27      瀏覽次數(shù):20031
    • 酶切反應(yīng)條件的優(yōu)化當(dāng)建立NEB內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系時(shí)有幾個(gè)關(guān)鍵因素需要考慮。下面整理了以下有關(guān)NEB內(nèi)切酶反應(yīng)的經(jīng)驗(yàn)和技巧。
      標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系:
      限制性內(nèi)切酶10units*
      DNA1μg
      10XNEBuffer5μl(1X)
      總反應(yīng)體系50μl
      溫育溫度因酶而異
      溫育時(shí)間60分鐘
      *足夠切割所有類型的DNA。
      省時(shí)酶切反應(yīng)體系:
      限制性內(nèi)切酶1μl
      DNA1μg
      10XNEBuffer5μl(1X)
      總反應(yīng)體系50μl
      溫育溫度因酶而異
      溫育時(shí)間5-10分鐘*
      *具有省時(shí)酶切特性的內(nèi)切酶也可以過夜反應(yīng)而沒有星號(hào)活性。
      NEB內(nèi)切酶
      •從冰箱取出后請一直置于冰上。
      •酶zui后加入到反應(yīng)體系中。
      •加入酶之前將反應(yīng)混合物混勻,可以用移液槍上下吹打或輕彈管壁,然后在離心機(jī)中快速離心。切忌振蕩混勻。
      •一般情況下,我們推薦使用5-10單位酶量/μgDNA,基因組DNA用10-20單位酶量消化1小時(shí)。
      •NEB推出一系列的高保真(HFTM)內(nèi)切酶,為建立酶切反應(yīng)體系提供了更多便利。
      •如果使用RE-Mix®,請參考2013﹒2014商品目錄276頁的操作方法。
      DNA
      •避免酚、氯仿、酒精、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染。推薦在純化過程中多清洗幾次。
      •甲基化的DNA會(huì)抑制某些酶的切割效率。
      緩沖液
      •使用終濃度為1X的緩沖液。
      •BSA已被添加到NEB緩沖液1.1、1.2、1.3和CutSmart緩沖液中,無需額外添加BSA。
      •在不需要BSA即可達(dá)到*活性的酶切反應(yīng)中如果加入BSA也不會(huì)影響酶切效果。
      反應(yīng)體系
      •建議在50μl反應(yīng)體系中消化1μg底物DNA。
      •加入內(nèi)切酶的量應(yīng)不超過總體積的10%,以避免甘油過量引起的星號(hào)活性。
      •內(nèi)切酶貯存液中的添加物(如:甘油和鹽)和底物溶液中尚存的殘余物(如:鹽、EDTA或乙醇)會(huì)導(dǎo)致小體積反應(yīng)出現(xiàn)問題。下述為小體積反應(yīng)技術(shù)指南。
      酶切反應(yīng)體系的選擇
      *當(dāng)內(nèi)切酶用量小時(shí),用推薦稀釋液稀釋后使用。
      **使用10μl反應(yīng)體系時(shí),溫育時(shí)間不要超過1小時(shí),以防蒸發(fā)。
      溫育時(shí)間
      •標(biāo)準(zhǔn)體系溫育1小時(shí),省時(shí)酶切體系溫育5-15分鐘。
      •使用省時(shí)內(nèi)切酶。
      •許多內(nèi)切酶都可以用更少單位的酶消化16小時(shí)。
      終止反應(yīng)
      若消化后的DNA不需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作:
      •用終止液終止反應(yīng)[50%甘油、50mMEDTA(pH8.0)和0.05%溴酚藍(lán)](如NEB#B7021)。按每50μl反應(yīng)體系中加入10μl的比例進(jìn)行。
      若消化后的DNA需要進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作:
      •用熱失活法(以確定該酶能否熱失活)。
      •若該酶不能熱失活,利用商業(yè)化的離心柱或酚/氯仿抽提去除內(nèi)切酶。
      貯存
      •大多數(shù)內(nèi)切酶建議保存在-20℃。只有少數(shù)NEB內(nèi)切酶若貯存時(shí)間超過30天建議保存在-70℃。
      •10XNEBuffer也應(yīng)保存在-20℃。
      穩(wěn)定性
      •NEB每4個(gè)月都會(huì)對所有的內(nèi)切酶進(jìn)行活性檢測。使用期限標(biāo)注在每管產(chǎn)品的標(biāo)簽上。
      •在任何情況下,都應(yīng)盡可能的避免將酶置于高于-20℃的溫度下。
      對照反應(yīng)
      如果在切割底物DNA時(shí)遇到了問題,建議加入以下對照實(shí)驗(yàn):
      •酶切對照DNA(含有多個(gè)已知內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的DNA,如LambdaDNA或腺病毒-2DNA),以檢測內(nèi)切酶的活性。
      •如果對照DNA能夠被切割而實(shí)驗(yàn)中的底物DNA不能,可以將這兩種DNA混合在一起再進(jìn)行酶切,以檢測實(shí)驗(yàn)用的底物DNA中是否存在抑制反應(yīng)的物質(zhì)。如果確實(shí)存在某種抑制因子(通常為鹽、EDTA或酚),則混合之后對照DNA也不能被切割。
      星號(hào)活性
      •當(dāng)內(nèi)切酶在非zui適條件下使用時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生星號(hào)活性。
      •可以通過以下方法降低星號(hào)活性:使用高保真(HF)內(nèi)切酶、縮短溫育時(shí)間、使用省時(shí)內(nèi)切酶或者增大反應(yīng)體積。