耐熱dna聚合酶多應用在PCR技術中。各種耐熱DNA聚合酶均具有5'-3'聚合酶活性,但不一定具有3'-5'和5'-3'的外切酶活性。3'-5'外切酶活性可以消除錯配,切平末端;5'-3'外切酶活性可以消除合成障礙。由于上述這些不同,可以將耐熱DNA聚合酶分為三類: 一、普通耐熱DNA聚合酶
由一種水生棲熱菌yT1株分離提取出,是發(fā)現的耐熱DNA聚合酶中活性zui高的一種,達200,000單位/mg。具有5'-3'外切酶活性,但不具有3'-5'外切酶活性,因而在合成中對某些單核苷酸錯配沒有校正功能。
TaqDNA聚合酶還要具有非模板依賴性活性,可將PCR雙鏈產物的每一條鏈3'加入單核苷酸尾,故可使PCR產物具有3'突出的單A核苷酸尾;另一方面,在僅有dTTP存在時,它可將平端的質粒的3'端加入單T核苷酸尾,產生3'端突出的單T核苷酸尾。應用這一特性,可實現PCR產物的T-A克隆法。
TthDNA聚合酶
從ThermusthermophilusHB8中提取而得,該酶在高溫和MnCl2條件下,能有效地逆轉錄RNA;當加入Mg2+后,該酶的聚合活性大大增加,從而使cDNA合成與擴增可用一種酶催化。
二、高保真DNA聚合酶
pfuDNA聚合酶
是從Pyrococcusfuriosis中精制而成的高保真耐高溫DNA聚合酶,它不具有5'-3'外切酶活性,但具有3'-5'外切酶活性,可校正PCR擴增過程中產生的錯誤,使產物的堿基錯配率極低。PCR產物為平端,無3'端突出的單A核苷酸。
VentDNA聚合酶
該酶是從Litoralis棲熱球菌中分離出的,不具有5'-3'外切酶活性,但具有3'-5'外切酶活性,可以去除錯配的堿基,具有校對功能。
三、DNA序列測定中應用的耐熱DNA聚合酶
BcaBestDNA聚合酶
從BacillusCaldotenaxYT-G菌株中提純,并使其5'-3'外切酶活性缺失的DNA聚合酶。它的伸長性能*;可抑制DNA二級結構形成,可以得到均一的DNA測序帶。
SacDNA聚合酶
從酸熱浴流化裂片菌中分離,無3'-5'外切酶活性,可用于DNA測序,但測序反應中ddNTP/dNTP的比率要高。